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Western Blot 转印迹膜滤纸的选择

Western Blot转印迹膜滤纸的选择解答:如果是用的是半干转,顺序为:阴极-》滤纸-》胶-》膜-》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1-2mm,而膜的长宽分别比胶大1-2mm。优良禁忌:上下两层滤纸因为过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸。

JJ. 蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?
解答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12%SDS-PAge, 湿转36V , 3-5hrs就可以了,可以根据你实验室的经验调节;170kd 用7%SDS-page, 48V 10hrs-16hrs。

KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?
解答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用上等的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。

LL. 如何选择*合适的蛋白杂交膜?
解答:蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素,我们要量体裁衣,从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜:硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,虽然这其中的机制还不是十分清楚,但由于硝酸纤维素膜的这个特性,而且易于封闭非特异性结合,从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小,要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm,蛋白的转移就很难进行了。因此,我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜,小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了,如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看,*重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关,市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素,因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素,保证了*大的蛋白结合量,可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度,因而也大大减少了非特异性的结合,降低杂交背景,无需高严谨度的洗脱步骤。其次,膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆,漂洗一两次就会破损,不能反复使用。
PVDF转移膜:PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质。PVDF膜可以结合蛋白质,而且可以分离小片段的蛋白质,*初是将它用于蛋白质的序列测定,因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解,所以就寻找了PDVF作为替代品,虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高,但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品,一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样,可以进行各种染色和化学发光检测,也有很广的适用范围。这种PVDF膜,灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高,非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子交换型转移膜:硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的,还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团,包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下,DEAE基团都能带电荷,在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其*适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜,除了可以做WesternBlotting外,还可以用于核酸结合研究。
还有一种离子交换型膜是羧甲基(CM)修饰的纤维素膜,它可以结合蛋白和多肽分子,以及其他的一些带正电荷的样品,*适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来,用于氨基酸系列分析或微测序

 

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